Las alteraciones en los glóbulos rojos del pez cavernario proporcionan evidencia de adaptación al oxígeno subterráneo reducido

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 3735 (2022) Citar este artículo

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Los animales que habitan en ambientes extremos brindan la poderosa oportunidad de examinar la evolución adaptativa en respuesta a diversas presiones. Una de esas presiones es el oxígeno reducido, comúnmente presente en ambientes subterráneos y de gran altitud. Los animales que habitan en cuevas también deben lidiar con la oscuridad y el hambre, los cuales se han estudiado rigurosamente como fuerzas clave que impulsan la evolución de los rasgos asociados con las cuevas. Curiosamente, la hipoxia como presión ambiental ha recibido menos atención. Aquí examinamos los fenotipos putativamente adaptativos que evolucionan en un pez teleósteo de agua dulce, Astyanax mexicanus, que incluye formas que habitan tanto en la superficie como en cuevas. Este sistema modelo también brinda la oportunidad de identificar respuestas convergentes a la hipoxia, debido a la presencia de numerosas poblaciones de cuevas naturales y colonizadas de forma independiente, junto con congéneres de superficie estrechamente relacionados. El enfoque de este estudio es la hemoglobina, una molécula esencial para el transporte y suministro de oxígeno. Descubrimos que múltiples poblaciones de cuevas albergan una mayor concentración de hemoglobina en la sangre, lo que coincide con un aumento en el tamaño de los eritrocitos de morfo de cueva en comparación con los peces de superficie. Curiosamente, tanto los morfos de cueva como los de superficie tienen números comparables de eritrocitos por unidad de sangre, lo que sugiere que la hemoglobina elevada no se debe a la sobreproducción de glóbulos rojos. Alternativamente, debido a un área celular aumentada de eritrocitos en cavefish, razonamos que contienen más hemoglobina por eritrocito. Estos hallazgos respaldan la idea de que los peces de las cavernas se han adaptado a la hipoxia en las cuevas a través de la modulación tanto de la producción de hemoglobina como del tamaño de los eritrocitos. Este trabajo revela una característica adaptativa adicional del pez de las cavernas Astyanax y demuestra que los cambios coordinados entre la arquitectura celular y los cambios moleculares son necesarios para que los organismos evolucionen bajo una intensa presión ambiental.

Nuestra comprensión de las complejas interacciones entre las condiciones ambientales extremas y la respuesta de los organismos a estas presiones sigue siendo incompleta. Un poderoso modelo natural para estudiar la adaptación en ambientes extremos es el pez cavernario mexicano ciego, Astyanax mexicanus (Fig. 1a). Esta especie permite comparaciones directas de dos morfotipos existentes, un morfo de 'superficie' que habita en el río y morfos de 'cueva' subterráneos obligados. Treinta poblaciones existentes de cuevas1 están distribuidas a través de redes de cuevas subterráneas dentro del karst de piedra caliza expuesta de la región de la Sierra de El Abra en el noreste de México (Fig. 1a). Los cambios fenotípicos han acompañado esta transición de la superficie a la cueva, durante un período estimado de ~ 20 a 500 mil años2,3, incluida la pérdida de los ojos, la pigmentación y la mejora de los sentidos no visuales. En las 8 décadas desde su descubrimiento4, se ha logrado un progreso considerable hacia la comprensión de los mecanismos subyacentes a las características regresivas, sin embargo, las presiones ambientales del sistema kárstico de El Abra han examinado principalmente los efectos de la luz y la nutrición limitadas5.

Múltiples poblaciones de peces de las cavernas Astyanax mexicanus tienen concentraciones más altas de hemoglobina en comparación con los peces de superficie. Astyanax mexicanus consta de morfotipos de cueva y de superficie. Los morfos de cueva se distribuyen en numerosas cuevas de la Sierra de El Abra en el noreste de México, mientras que los morfos de superficie residen en ríos, arroyos y lagos cercanos (a). Cada una de las tres poblaciones de peces de las cavernas mostró concentraciones de hemoglobina estadísticamente significativamente más altas que el morfo de superficie conespecífico (b, Chica WRS p = 0.005, Tinaja WRS p = 0.0005, Pachón WRS p = 0.0001). Las concentraciones de hemoglobina se midieron mediante análisis espectrofotométrico (c). No se detectaron valores atípicos.

Una presión ambiental comúnmente presente en las cuevas subterráneas, los niveles reducidos de oxígeno, ha recibido mucha menos atención. Los entornos subterráneos de todo el mundo suelen tener niveles reducidos de oxígeno en comparación con los entornos terrestres circundantes debido a la respiración de los organismos6, la ausencia de aportes fotosintéticos6 y la mezcla limitada de aire con la atmósfera superficial7. Se han realizado mediciones empíricas de oxígeno disuelto en dos cuevas de El Abra, Pachón y Tinaja, que demuestran niveles de oxígeno significativamente más bajos en las piscinas de las cuevas en comparación con las aguas superficiales circundantes (OD = 2,97 mg/L en la cueva de Pachón en comparación con 8,20 mg/L en el ambiente superficial (Rascón); 59% de saturación en la cueva de Tinaja en comparación con 80% de saturación en el ambiente superficial (Nacimiento del Río Choy) 8, 9. Aunque esta característica ambiental muy probablemente ha impactado la evolución del pez de las cavernas Astyanax, pocos estudios han abordó las supuestas características adaptativas que mitigan esta presión10,11,12.

Debido a los efectos globales del cambio climático13,14,15 y el consiguiente impacto en los niveles naturales de oxígeno disuelto, se ha estudiado la tolerancia a la hipoxia en varias especies de teleósteos. Las respuestas complejas a la hipoxia incluyen cambios de comportamiento (disminución de la evasión de depredadores en salmonetes16), cambios morfológicos (remodelación de branquias en carpa cruciana17) y cambios moleculares (aumento de la expresión del gen HIF-1 de detección de oxígeno en pez cebra18).

Para que llegue suficiente oxígeno a los tejidos periféricos, los vertebrados utilizan proteínas de hemoglobina como transportadores de oxígeno. Las moléculas de hemoglobina incluyen cuatro tetrámeros, cada uno de los cuales se une a una sola molécula de oxígeno, cargando cuatro moléculas de oxígeno por proteína de hemoglobina. Las concentraciones naturales de oxígeno pueden variar considerablemente según el entorno, y muchos animales requieren niveles precisos de oxígeno para mantener sus tasas metabólicas estándar. Por lo tanto, es probable que los genes y las proteínas de la hemoglobina hayan estado sujetos a cambios evolutivos en los taxones de vertebrados19. Estos incluyen la variación numérica en la organización genómica de los genes de la hemoglobina20, el aumento de la concentración de hemoglobina en tambaqui21 o el aumento de la afinidad de unión de la hemoglobina en el tambor rojo22. Aquí, examinamos la concentración de hemoglobina ya que es el principal transporte molecular para el suministro de oxígeno23.

Identificamos cambios en los peces de las cavernas que afectan la concentración de hemoglobina y el tamaño de los glóbulos rojos, que probablemente se adapten al entorno de la cueva con poco oxígeno. Estas alteraciones, que están ausentes en los morfos superficiales estrechamente relacionados, probablemente confieren tolerancia a la hipoxia en el pez de las cavernas Astyanax dado que fueron criados (y persisten) en las mismas condiciones de cautiverio durante generaciones. Por lo tanto, este modelo brinda la oportunidad única de identificar la base genética de los cambios en el transporte de hemoglobina y la tolerancia a la hipoxia en la naturaleza.

La hemoglobina es la principal molécula de transporte de oxígeno en casi todos los vertebrados19. Primero razonamos que los niveles de hemoglobina pueden ser más altos en los morfos de las cuevas como una adaptación a la reducción de oxígeno en el ambiente de la cueva (en comparación con los ambientes terrestres suprayacentes6) según las mediciones directas de las cuevas de El Abra donde se encuentran los peces de las cavernas Astyanax8,9. Un mecanismo de adaptación para el oxígeno bajo es aumentar la concentración de hemoglobina24,25 para aumentar el oxígeno disponible para el transporte sistémico.

Utilizando un enfoque espectrofotométrico ("Material y métodos"), encontramos que la concentración media de hemoglobina en los peces de superficie (n = 26) fue de 8,25 ± 0,23 g/dL (Fig. 1b). Las tres poblaciones de cavefish examinadas (Chica, Tinaja y Pachón cavefish) tenían concentraciones medias de hemoglobina significativamente más altas que los peces de superficie (Chica n = 8, media = 9,86 ± 0,43 g/dL, Wilcoxon Rank-Sum (WRS) p = 0,005; Tinaja n = 8, media = 10,60 ± 0,38 g/dL, WRS p = 0,0005, Pachón n = 30, media = 10,49 ± 0,39 g/dL, WRS p = 0,0001; Fig. 1b), pero no difirieron entre sí (Fig. .1b). Presumiblemente, las concentraciones más altas de hemoglobina permiten que los morfos de cuevas hagan frente al oxígeno disuelto limitado en la cueva. Sin embargo, es posible que diversas características celulares contribuyan a aumentar la concentración de hemoglobina, por lo que a continuación examinamos las características celulares de los eritrocitos (es decir, los glóbulos rojos).

El hematocrito es la porción de un volumen sanguíneo dado ocupada por eritrocitos (Fig. 2a). Ciertos fenotipos clínicos en humanos, por ejemplo, la policitemia vera26, se diagnostican en función de valores elevados de hematocrito27,28. Por lo tanto, las concentraciones más altas de hemoglobina en los peces de las cavernas pueden deberse a la presencia de más eritrocitos en comparación con los peces de superficie. Para determinar si la hemoglobina elevada está mediada por la sobreproducción de glóbulos rojos, comparamos el hematocrito entre los morfos de superficie y de cueva.

El hematocrito tiende a ser más alto en los peces de las cavernas que en los peces de superficie. La fracción de glóbulos rojos en el volumen total de sangre (hematocrito) se determinó mediante centrifugación de tubos microcapilares. La fase eritrocitaria se acumula en el extremo distal del tubo capilar, mientras que la capa leucocitaria y el plasma se acumulan más proximalmente (a). Aunque no se logró significación estadística al comparar poblaciones individualmente (en comparación con la superficie; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161), se observó una clara tendencia de hematocrito más alto para cada población de cavefish en comparación con la superficie. (b). Sin embargo, cuando se compara por morfotipo (superficie contra todos los peces de las cavernas), los peces de las cavernas tienen un hematocrito medio más alto estadísticamente significativo (superficie n = 8, media = 28,51 ± 0,03 %, Cave n = 24, media = 36,14 ± 0,01 %, WRS p = 0,024) que los peces de superficie. Se detectó un valor atípico (el valor de Chica más bajo), aunque la significancia estadística no cambió (Tabla S6).

Las medidas de hematocrito tendieron a ser más altas en cada población de cuevas que examinamos en comparación con los peces de superficie (Fig. 2b). Primero realizamos una comparación (prueba Wilcoxon Rank Sum) entre morfos de superficie y morfos de pez cavernario (independientemente de las localidades individuales de pez cavernario) que reveló diferencias significativas entre estos grupos (superficie n = 8, media = 28,51 ± 0,03 %, cueva n = 24, media = 36,14 ± 0,01%, WRS p = 0,024). Luego realizamos un análisis post-hoc comparando cada una de las cuatro poblaciones entre sí. Estos resultados demostraron claramente la misma tendencia, pero no alcanzaron significación estadística después de la corrección de Bonferroni (en comparación con la superficie; Chica WRS p = 0,115, Tinaja WRS p = 0,018, Pachón WRS p = 0,161, debido a la corrección de Bonferroni, los valores de p deben ser < 0.0083 para lograr significación estadística). Sin embargo, el hematocrito uniformemente elevado en el pez de las cavernas no fue sorprendente dado que los peces de las cavernas tienen concentraciones de hemoglobina más altas. De acuerdo con las medidas de hemoglobina, la población de la cueva de Tinaja albergaba el valor de hematocrito más alto (hematocrito medio = 39,23 ± 0,03 %, Fig. 2b), seguida por la cueva de Pachón (hematocrito medio = 35,56 ± 0,03 %, Fig. 2b), con la Chica población de cuevas que demuestra el hematocrito más bajo (hematocrito medio = 33,63 ± 0,01%, Fig. 2b) de las poblaciones de cuevas. Dados estos resultados, examinamos a continuación la variación numérica de los glóbulos rojos para cada población.

Anticipamos que las poblaciones de peces de las cavernas pueden tener una mayor densidad de eritrocitos que los peces de superficie, lo que refleja concentraciones de hemoglobina y valores de hematocrito más altos. Inesperadamente, los peces de superficie tenían la mayor densidad de eritrocitos (n = 8, densidad media = 2,1 × 106 ± 1,4 × 105/mm3, Fig. 3c-c′), seguidos de cerca por el pez de las cavernas Pachón (n = 8, densidad media = 2,0 × 106 ± 8,2 × 105/mm3, Fig. 3f-f′). Curiosamente, Tinaja y Chica cavefish tenían densidades medias ligeramente más bajas (n = 8, 1,6 × 106 ± 1,8 × 105/mm3 y n = 8, 1,5 × 106 ± 6,7 × 104/mm3, Fig. 3d–e′ respectivamente). Aunque Chica fue estadísticamente diferente a Pachón (WRS p = 0.001, Fig. 3b), estos individuos fueron obtenidos comercialmente como adultos ("Material y métodos") y por lo tanto se desconoce su edad precisa. En general, las densidades de eritrocitos fueron comparables entre los morfos de la superficie y de la cueva, lo que no se anticipó dadas las concentraciones más altas de hemoglobina y los valores de hematocrito en las poblaciones de la cueva. Dado que la densidad de eritrocitos generalmente se redujo en los peces de las cavernas, consideramos si las diferencias en el tamaño de las células de los eritrocitos podrían explicar la mayor concentración de hemoglobina en los morfos de las cavernas.

La densidad de eritrocitos es comparable entre los morfotipos de Astyanax. Determinamos la densidad de eritrocitos en un volumen de sangre estándar usando un hemocitómetro (a). Aunque se detectó una diferencia estadística para la población Chica (p < 0,0023), la densidad media de eritrocitos fue comparable entre los morfotipos (b). Los eritrocitos se tiñeron con naranja de acridina, se visualizaron al microscopio óptico (c–f) y se contaron con ImageJ29 (v2.0.0) (c′–f′, barra de escala de 130 µm). Se detectaron dos valores atípicos (el valor más bajo en superficie y el más alto en Chica). La eliminación de estos valores atípicos resultó en una diferencia estadísticamente significativa entre Chica y Surface (Tabla S6).

Medimos el área bidimensional de eritrocitos en volúmenes de sangre estándar para determinar si el tamaño de los glóbulos rojos varía entre las poblaciones de cuevas y superficies. Se recogieron frotis de sangre, se tiñeron y se analizaron mediante microscopía óptica. Los eritrocitos se identificaron sin ambigüedades ("Material y métodos"), se puntuaron manualmente en unidades de píxeles (ImageJ29 v2.0.0) y se convirtieron a µm para una comparación directa. Dado que los peces de las cavernas tienen un hematocrito y una hemoglobina elevados, pero densidades de eritrocitos comparables, anticipamos que cada población de cuevas puede mostrar áreas de eritrocitos más grandes. De hecho, los eritrocitos de peces de superficie fueron los más pequeños de todas las poblaciones (n = 8, área media = 71,36 ± 1,43 µm2, Fig. 4a), mientras que los eritrocitos de la población de Tinaja fueron, en promedio, los más grandes de las poblaciones de cuevas (n = 8, área media = 71,36 ± 1,43 µm2, Fig. 4a). = 86,05 ± 0,96 µm2, Fig. 4c), seguida de Chica (área media = 85,70 ± 1,38 µm2, Fig. 4b) y Pachón cavefish (área media = 84,06 ± 1,52 µm2, Fig. 4d). Los eritrocitos para las tres poblaciones de cuevas fueron significativamente más grandes que los peces de superficie (Chica WRS p = 0.0002, Tinaja WRS p = 0.0002, Pachón WRS p = 0.0006, Fig. 4e). Este aumento del tamaño de la celda no fue acompañado por un aumento en el área nuclear. Para cada población, incluidos los peces de superficie, el área bidimensional del núcleo no difirió en más de 0,5 µm2 (14,9 ± 0,24 µm2, Fig. 4f), lo que sugiere que las diferencias en el área de los eritrocitos se atribuyen al aumento del citoplasma celular, en el que se encuentra la hemoglobina.

El área superficial bidimensional de los eritrocitos cavernosos es significativamente mayor que la de los eritrocitos superficiales. Los eritrocitos de cada población se tiñeron con Wright-Giemsa y se visualizaron al microscopio óptico (a-d, barra de escala de 10 µm). El área bidimensional total (a–d, anillo amarillo) y nuclear (a–d, anillo azul oscuro) se calculó para cada eritrocito en ImageJ29 (v2.0.0). El área de superficie total fue significativamente mayor en todas las poblaciones de cuevas en comparación con la superficie (p < 0,00003), pero no difirió entre sí (e). Aunque el área bidimensional total fue mayor en los cavefish, no hubo diferencias en el área bidimensional de los núcleos (f), lo que sugiere que las diferencias en el área bidimensional total se deben a diferencias en el citoplasma, donde se encuentra la hemoglobina. . Se detectaron dos valores atípicos (el valor más alto de Chica y el valor más bajo de Pachón). La eliminación de estos valores atípicos no cambió la significación estadística (Tabla S6).

Si las diferencias en el hematocrito entre las poblaciones no se rigen por un mayor número de eritrocitos, razonamos que la variación del hematocrito puede estar correlacionada con las diferencias en el tamaño de los eritrocitos. Las comparaciones cualitativas parecían demostrar esta tendencia, por lo que para probar esto cuantitativamente, realizamos correlaciones tanto para el tamaño medio de los eritrocitos como para la densidad media de los eritrocitos, en relación con el valor medio del hematocrito. Las medidas de densidad de eritrocitos mostraron una pobre correlación con el hematocrito (r = -0.433, Fig. 5a). En contraste, el área de eritrocitos demostró una fuerte correlación positiva con el hematocrito (r = 0.869, Fig. 5b), lo que sugiere que la variación en el hematocrito elevado entre las poblaciones de peces de las cavernas Astyanax es una función del tamaño de los eritrocitos.

El tamaño de los eritrocitos se correlaciona positivamente con los valores de hematocrito en los peces de cueva y superficie de Astyanax. Realizamos las correlaciones de Pearson para determinar qué característica eritrocítica (densidad o tamaño) se correlaciona con el hematocrito. La densidad media de eritrocitos no se correlacionó con el hematocrito (r = − 0,4329, a). Sin embargo, el área superficial bidimensional de los eritrocitos de la población proporcionó una fuerte correlación positiva con el valor del hematocrito (r = 0,8688, b).

Evaluamos esto aún más mediante el cálculo de la hemoglobina corpuscular media (MCH, "Material y métodos"), una métrica que integra la concentración de hemoglobina con la densidad de eritrocitos para estimar la masa de hemoglobina en un solo glóbulo rojo. De acuerdo con otros hallazgos, la población de la superficie tuvo el valor medio más bajo de MCH (media de MCH = 39,41 pg, Tabla 1), mientras que la población Chica tuvo la más alta de las tres poblaciones de cuevas, seguida por Tinaja y Pachón (media de MCH = 66,01 pg, 65,02 pg y 52,20 pg, respectivamente; Tabla 1). Por lo tanto, el aumento del tamaño de los eritrocitos (relacionado con un hematocrito elevado) probablemente contribuya a aumentar los niveles de hemoglobina en las poblaciones naturales de peces de las cavernas.

En los seres humanos, las puntuaciones de hematocrito proporcionan una medida relativa del porcentaje de contribución de eritrocitos a un volumen dado de sangre, debido al hecho de que el tamaño de los glóbulos rojos es estable en toda la población humana30. Los peces de las cavernas tienen niveles más altos de hemoglobina en comparación con los peces de superficie. Los niveles de hematocrito están elevados en los peces de las cavernas, pero es probable que esto sea una función de los eritrocitos más grandes (en lugar de más).

Aquí, informamos que los morfos de cuevas de Astyanax (de tres localidades de cuevas distintas: Chica, Pachón y Tinaja) han desarrollado convergentemente concentraciones más altas de hemoglobina en sangre en comparación con los peces de superficie estrechamente relacionados. Esta hemoglobina elevada podría permitir que el pez cavernario entregue más oxígeno a los tejidos sistémicos por unidad de tiempo. Esto puede permitir que se mantenga la respiración aeróbica durante los períodos de oxígeno reducido para apoyar la actividad de alimentación sostenida31,32,33,34. De acuerdo con el aumento de la hemoglobina, los morfos de las cavernas tienen puntajes de hematocrito más altos. Aunque esto típicamente indica una mayor densidad de eritrocitos27,28, los peces de las cavernas no tenían más glóbulos rojos en comparación con los peces de superficie. Más bien, el tamaño de los eritrocitos varió entre las poblaciones de cuevas y superficies, y los peces de las cavernas albergaron uniformemente un mayor tamaño de glóbulos rojos que explica, en parte, sus niveles más altos de hemoglobina.

Entre las presiones ambientales desafiantes que enfrentan los peces de las cavernas, como la oscuridad perpetua y la nutrición limitada, se incluyen niveles más bajos de oxígeno en comparación con las aguas superficiales suprayacentes6. Se ha demostrado que el oxígeno limitado afecta el comportamiento, la fisiología y ciertas morfologías en otras especies de teleósteos16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,35. Los estudios futuros en nuestro sistema brindan la oportunidad de comparar directamente estas características entre el morfo 'ancestral sustituto' conespecífico, que vive en ambientes bien oxigenados, con los morfos de cueva derivados que han prosperado en aguas con poco oxígeno durante decenas a cientos de miles de años2, 3.

La discrepancia en el tamaño de los eritrocitos entre las poblaciones de Astyanax proporciona al menos una explicación para el aumento de la concentración de hematocrito y hemoglobina en los morfos de cueva. Curiosamente, el tamaño de los eritrocitos varía mucho entre las especies de teleósteos. Snyder y Sheafor36 sugirieron que la variación en el tamaño de los eritrocitos mantiene una difusión de oxígeno eficiente, pero en función de los diámetros capilares variables. Aunque tanto el tamaño de las células como el de los capilares pueden variar entre los taxones, la relación entre los dos permanece constante. En promedio, el ancho de los eritrocitos es un 25% mayor que el diámetro de los capilares36. Curiosamente, no encontraron relación entre el tamaño de los eritrocitos y la capacidad de transporte de oxígeno (incluida la concentración de hemoglobina), por lo que concluyeron que el tamaño de los eritrocitos varía para mantener un flujo y una difusión eficientes.

Lay y Baldwin37 investigaron si el tamaño del núcleo o el suministro de oxígeno explican mejor la variación del tamaño de los eritrocitos en 52 especies de teleósteos y encontraron una relación inversa entre el tamaño de los eritrocitos y la concentración de hemoglobina. Curiosamente, también informaron una relación inversa entre el tamaño de los eritrocitos y la capacidad de natación aeróbica28,38. Específicamente, los peces que nadan con ráfagas cortas de movimiento rápido tienden a tener eritrocitos más pequeños, y el aumento de la natación aeróbica se relacionó con un mayor número de eritrocitos39.

Una explicación de esta relación puede ser que una mayor relación área superficial/volumen en los eritrocitos reduce la distancia de difusión de oxígeno, lo que permite una carga de oxígeno más rápida cuando es necesario37. Dado que el volumen aumenta más rápido que el área de la superficie, y los eritrocitos de los peces de las cavernas son más grandes que los de los peces de la superficie, es probable que los eritrocitos de los peces de las cavernas tengan una relación menor entre el área de la superficie y el volumen. La actividad de la forma de cueva se ha caracterizado por una velocidad media más alta en comparación con los peces de superficie34, sin embargo, los peces de superficie utilizan movimientos rápidos, cortos y de 'ráfaga'40. Dado que los peces de las cavernas poseen menos eritrocitos, pero más grandes, esto podría reflejar sus diferentes niveles de actividad natural. Resultados similares fueron discutidos por Tang et al.12 en el contexto de las diferencias en el tamaño y forma del corazón entre morfotipos. Los peces de las cavernas poseen corazones más pequeños, menos triangulares pero, por lo tanto, más "esponjosos" que los peces de superficie. Los corazones más esponjosos tienen una proporción más pequeña de tejido de pared compacta a trabéculas, lo que se asocia con un perfil de actividad sedentaria41. Además, los corazones con más trabéculas tienen un área de superficie más grande expuesta a la sangre circulante, lo que permite un mayor intercambio de gases que, por lo tanto, puede ofrecer una ventaja para los peces de las cavernas en ambientes hipóxicos12.

Aquí medimos varios fenotipos sanguíneos que probablemente proporcionen una ventaja adaptativa para el pez de las cavernas Astyanax en cuevas hipóxicas. Sin embargo, todavía se desconoce mucho, incluidos los mecanismos subyacentes que permiten la resistencia a la hipoxia en esta especie. Los estudios futuros diseñados para caracterizar los cambios generales en la expresión génica en respuesta al cautiverio por hipoxia42,43,44 pueden revelar genes clave expresados ​​diferencialmente que afectan la tolerancia a la hipoxia. Por ejemplo, ciertas poblaciones de cíclidos nativos del lago Victoria45,46 demuestran una expresión diferencial de hemoglobina basada en la exposición variable a la hipoxia de las poblaciones ancestrales. Además, los cambios en la secuencia de codificación en los genes de la hemoglobina pueden afectar la función de la proteína codificada, posiblemente mejorando la capacidad de unión de oxígeno en niveles variables de oxígeno ambiental a lo largo del tiempo evolutivo20.

Un cuerpo considerable de investigación ha identificado docenas de respuestas adaptativas a la hipoxia en teleósteos47. Otras adaptaciones en Astyanax pueden incluir cambios en la anatomía y función de las branquias. Por ejemplo, Moran et al.11 observaron que las branquias del pez de las cavernas de Pachón son más pesadas en comparación con los morfos de superficie, y que la masa media de branquias de los híbridos Pachón/superficie F2 era mayor que la población de superficie parental. Esto puede indicar que ocurre una selección positiva como consecuencia de la hipoxia en las cuevas11. La carpa cruciana puede 'remodelar' sus branquias para mejorar el intercambio de oxígeno y limitar el intercambio iónico innecesario y energéticamente costoso17,48. Posiblemente, alteraciones similares en la morfología de las branquias pueden proporcionar una captación de oxígeno y una conservación de energía más eficientes en cuevas hipóxicas.

Finalmente, además de la evolución de características regresivas (p. ej., pérdida de ojos), muchas características sensoriales constructivas no visuales han evolucionado en cavefish, como expansiones de la línea lateral49,50 y sistemas gustativos51,52. Una modalidad sensorial no examinada en Astyanax es la detección de oxígeno. Las células neuroepiteliales (NEC, por sus siglas en inglés) son las principales células detectoras de oxígeno en los peces y se distribuyen a lo largo de una fina capa epitelial dentro de los filamentos branquiales y laminillas, que cubren el aspecto eferente de las branquias53. Debido a la posición de estas células, pueden desempeñar un papel en la detección de cambios tanto externos (agua ambiental) como internos (arteriolas) en la presión parcial de oxígeno53. Además, estas células son homólogas a los quimiorreceptores de tipo I ubicados en el cuerpo carotídeo de los mamíferos54. Las diferencias clave en la expresión de canales iónicos de NEC contribuyen a la tolerancia al oxígeno en peces de colores resistentes a la anoxia55. Dado que otros sistemas sensoriales aumentan como consecuencia de la vida en el ambiente extremo de la cueva, alteraciones similares en la detección de oxígeno pueden haber evolucionado de manera similar para hacer frente a condiciones de oxígeno reducido.

Todos los animales utilizados en este estudio se mantuvieron en una instalación acuática satélite en la Universidad de Cincinnati y se alojaron en tanques de 5 o 10 galones en una unidad de cría personalizada de ósmosis inversa con múltiples filtros (carbono, micras, UV y partículas densas). filtros; Aquaneering, San Diego, CA). Este sistema acondiciona el agua a una temperatura de 24 ° (± 2 °C), un pH de 7,4 (± 0,2) y una conductividad de 750 µS/cm (± 50 µS/cm) mediante el control de dosis en tiempo real. Tanto las poblaciones de cuevas de Astyanax (Pachón, Tinaja y Chica) como los morfos de superficie se alojaron en un ciclo de luz:oscuridad de 12 h: 12 h y se alimentaron una vez al día (~ 9:00 a. m.) con una mezcla de alimento seco en escamas (TetraMin Pro) y agua del sistema. . Los peces de superficie, Tinaja y Pachón utilizados en este estudio se derivaron de especímenes adultos reproductores de Astyanax mexicanus proporcionados originalmente por el Dr. Richard Borowsky. Los peces de las cavernas Chica fueron adquiridos comercialmente y, por lo tanto, se desconoce la edad precisa de estos individuos. Ciertos parámetros sanguíneos, incluido el hematocrito, pueden cambiar con la edad en los seres humanos, por lo que minimizamos la variación biológica en este estudio al excluir peces de <40 mm de longitud estándar. Las medidas de longitud estándar no se registraron para cada individuo, aunque cada individuo superó los 40 mm de longitud estándar.

Los animales se anestesiaron con agua del sistema helada y se extrajo sangre a través de la vena caudal con una jeringa 31G (BD Ultra-Fine™, BD Biosciences, San Jose, CA). Utilizamos peces de edad y longitud estándar comparables en todas las poblaciones y descubrimos que ningún factor afectó significativamente ninguna puntuación fenotípica en este estudio (Tablas complementarias S1–S4). Las recolecciones ocurrieron entre las 12:00 y las 5:00 p. m. para minimizar cualquier posible efecto diurno. Todas las condiciones de alojamiento y los métodos de recolección fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cincinnati (protocolo IACUC n.° 10-01-21-01).

Las concentraciones de hemoglobina se midieron con un medidor de hemoglobina Aimstrip (Germaine Laboratories, San Antonio, TX, EE. UU.). El medidor fue calibrado y verificado ópticamente antes de cada uso según las instrucciones del fabricante. Se colocaron 10 µL de sangre entera en una tira reactiva (Fig. 1c) y se insertaron en el Medidor de Hemoglobina. Las concentraciones se calcularon automáticamente mediante espectrofotometría y se mostraron en g/dl.

Los valores de hematocrito se midieron mediante centrifugación utilizando una centrífuga LW Scientific ZipCombo (LW Scientific, Lawrenceville, GA) equipada con un rotor de microhematocrito de 12 posiciones. La sangre completa se recogió en un tubo capilar y se selló en el extremo opuesto con arcilla. Cada tubo capilar se hizo girar durante 3 min a 12.000 rpm, según las recomendaciones del fabricante. Los componentes de la sangre se separaron en fases: los eritrocitos mucho más numerosos y más grandes se acumulan en la fase inferior, mientras que la capa leucocitaria (principalmente glóbulos blancos y plaquetas) y el plasma sanguíneo se superponen a los eritrocitos (Fig. 2a). Se midieron la duración de la fase eritrocítica y la duración del volumen total de sangre. La fracción de hematocrito se determinó dividiendo la duración de la fase eritrocitaria por el volumen total de sangre.

Para determinar la densidad de eritrocitos para cada población, se utilizó un hemocitómetro de Neubauer mejorado (Hausser Scientific, Horsham, PA) (Fig. 3a). Se diluyó 1 µl de sangre completa en una solución de tinción de 500 µl de solución salina tamponada con fosfato (1×) y 20 µl de una solución de trabajo de la tinción nuclear naranja de acridina (A1301, Invitrogen de Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Esta dilución se incubó a temperatura ambiente durante 20 min. Después de la incubación, se colocaron 10 µL en el hemocitómetro y se visualizaron usando un microscopio compuesto LED Leica DM2000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Las imágenes se capturaron con una cámara Leica DMC4500 montada en el microscopio y el software Leica Application Suite (LAS) X (versión 3.0.1.15878).

El hemocitómetro está equipado con intrincados grabados de rejilla (Fig. 3a) para permitir un método preciso de contar el número de células dentro de un área precisa. El área cuadrada visible más grande con nuestro visor compuesto fue de 0,75 mm × 0,75 mm o 0,5625 mm2. Se contaron y promediaron tres áreas diferentes de 0,5625 mm2 para cada individuo.

Para estimar el volumen total, el hemocitómetro se diseñó de modo que los hombros a ambos lados de la plataforma soportaran un cubreobjetos exactamente 0,1 mm por encima de la plataforma. Así, el volumen total en esta sección es de 0,05625 mm3. Los recuentos de células se realizaron utilizando ImageJ29 (v2.0.0) utilizando primero la herramienta 'Umbral de color'. El umbral se ajustó manualmente para cada imagen para eliminar los artefactos ópticos. Luego se seleccionó el área cuadrada y se completó el conteo usando la herramienta 'Analizar partículas'. Esta herramienta permite la exclusión de tamaño para garantizar aún más que los artefactos no se cuenten. Los eritrocitos son mucho más grandes que los glóbulos blancos, por lo que excluimos las características de menos de 30 µm2. Calculamos el número de células por 1 mm3 (es decir, la densidad celular) dividiendo el recuento de células sin procesar por el volumen (0,05625 mm3) y multiplicando por el factor de dilución (520).

Se aplicaron 7,5 µl de sangre entera a un portaobjetos de microscopio, se frotó, se secó al aire y se tiñó con tinción modificada de Wright-Giemsa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (WG16, Millipore Sigma, Burlington, MA, EE. UU.). Se seleccionaron al azar nueve celdas y se midieron y promediaron manualmente para cada individuo. La orientación de cada celda seleccionada era paralela al portaobjetos (el diámetro de la celda corta y larga en la longitud máxima), sin tocar otra celda y libre de deformidades obvias. Se tomaron imágenes de todas las celdas y se midieron utilizando las herramientas 'Selección de polígonos' y 'Medir' en ImageJ29. Los píxeles se convirtieron a µm para cada imagen utilizando la barra de escala de imágenes (LAS X) durante la microscopía y las herramientas 'Línea recta' y 'Establecer escala' en ImageJ29. El área nuclear de cada eritrocito se midió usando el mismo protocolo empleado para medir el área bidimensional total, como se describe anteriormente.

Todos los análisis estadísticos se completaron en R56 (versión 3.6.1) utilizando los paquetes básicos 'stats'56 y 'Rmisc'57. Se usaron al menos ocho individuos de cada población para cada ensayo, ya que este era el mayor número de individuos elegibles de la población más pequeña en el laboratorio. Cuando fue posible, un investigador incorporó el cegamiento recopilando datos (células de imágenes), creando una clave de identificación y eliminando la nomenclatura individual antes de que un segundo investigador cuantificara y devolviera los datos al investigador uno. Se utilizaron pruebas de suma de rangos de Wilcoxon (WRS) para detectar la significación estadística de las concentraciones de hemoglobina, hematocrito, densidad de eritrocitos y tamaño de eritrocitos. Todos los valores de p para estos ensayos fueron corregidos por Bonferroni para comparaciones múltiples. Se logró significación estadística si p < 0,0083. Las correlaciones de Pearson se calcularon en R56 usando el paquete base 'stats'56. La normalidad se probó para cada población en cada ensayo utilizando la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk. Todas las poblaciones siguieron una distribución normal con la excepción de las mediciones del área nuclear 2d de Pachón (Tabla S5). Se realizó un análisis adicional para probar la presencia de valores atípicos. Probamos todas las poblaciones en cada ensayo utilizando el filtro de Hampel58. Esta prueba detectó valores atípicos, sin embargo, la eliminación de los valores atípicos afectó solo una significación estadística única (Fig. 3b, Tabla S6). Todos los datos recopilados (incluidos los valores atípicos) se presentan en este manuscrito. Se incluyeron peces machos y hembras en todos los ensayos. El sexo no parece ser un factor biológico en los parámetros sanguíneos que examinamos, según los análisis de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (n = 42 para la concentración de hemoglobina y n = 32 para las mediciones de hematocrito, densidad de eritrocitos y área 2d, cada morfo incluida) para cada ensayo (Tablas complementarias S1–S4). La hemoglobina corpuscular media (MCH) estima la masa de proteína de hemoglobina por eritrocito. Este valor se calcula dividiendo la cantidad de gramos de hemoglobina por litro por la cantidad de glóbulos rojos en millones por mililitro, lo que proporciona picogramos de hemoglobina por glóbulo rojo59. Los diagramas de dispersión se crearon en R56 utilizando el paquete 'ggpubr'60. Los diagramas de caja se crearon en R56 usando el paquete 'ggplot2'61. En estas gráficas, los bigotes se extienden al valor más pequeño o más grande que no supere 1.5xIQR y las líneas horizontales representan el primer y tercer cuartil y la mediana. Todas las imágenes fueron editadas en Microsoft PowerPoint (versión 16.23).

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cincinnati (protocolo IACUC n.° 10-01-21-01) aprobó todas las condiciones de alojamiento y los métodos de recolección para el uso de Astyanax mexicanus en este estudio. Además, este estudio se ajustó a los principios descritos en la Declaración de Basilea y las directrices ARRIVE.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en Información complementaria.

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Los autores desean agradecer a los miembros del laboratorio de Gross, actuales y anteriores, por los útiles debates sobre este proyecto y la asistencia con la cría de peces, en particular Daniel Berning y Alyssa Hamm.

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Cincinnati, Cincinnati, OH, 45221, EE. UU.

Tyler E. Boggs, Jessica S. Friedman y Joshua B. Gross

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TEB y JBG diseñaron experimentos, TEB y JSF realizaron experimentos, TEB y JBG analizaron los datos y TEB y JBG escribieron el texto principal. Todos los autores revisaron el manuscrito final.

Correspondencia a Joshua B. Gross.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Boggs, TE, Friedman, JS & Gross, JB Las alteraciones de los glóbulos rojos de los peces de las cavernas proporcionan evidencia de adaptación a la reducción del oxígeno subterráneo. Informe científico 12, 3735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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Recibido: 19 noviembre 2021

Aceptado: 15 febrero 2022

Publicado: 08 marzo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-07619-0

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