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Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2722 (2023) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Gran parte de nuestra comprensión del desarrollo, la estructura y la función de las células y los tejidos proviene de la microscopía de fluorescencia. La adquisición de imágenes coloridas y brillantes atrae y emociona a usuarios que van desde microscopistas experimentados hasta estudiantes de STEM. Los microscopios de fluorescencia varían en costo desde varios miles hasta varios cientos de miles de dólares estadounidenses. Por lo tanto, el uso de la microscopía de fluorescencia generalmente se limita a instituciones bien financiadas y compañías de biotecnología, instalaciones centrales de investigación y laboratorios médicos, pero es económicamente poco práctico en muchas universidades y colegios, escuelas primarias y secundarias (K-12) y en ciencias. configuración de alcance. En este estudio, desarrollamos y caracterizamos componentes que, cuando se usan en combinación con un teléfono inteligente o una tableta, realizan microscopía de fluorescencia a un costo de menos de $50 dólares estadounidenses por unidad. Rediseñamos las linternas LED recreativas y los filtros de iluminación del escenario del teatro para permitir la visualización de fluoróforos verdes y rojos, incluidos EGFP, DsRed, mRFP y mCherry en un marco de madera y plexiglás fácil de construir. Estos dispositivos, a los que nos referimos como luminoscopios, tenían una resolución de 10 µm, imágenes de fluorescencia en muestras vivas y eran compatibles con todos los modelos de teléfonos inteligentes y tabletas que probamos. En comparación con los microscopios de fluorescencia de grado científico, los luminoscopios pueden tener limitaciones en la sensibilidad necesaria para detectar la fluorescencia tenue y la incapacidad para resolver las estructuras subcelulares. Demostramos la capacidad de ver la fluorescencia dentro de los embriones de pez cebra, incluida la frecuencia cardíaca, la ritmicidad y la anatomía regional del sistema nervioso central. Debido al bajo costo de las unidades individuales de glowscope, anticipamos que este dispositivo puede ayudar a equipar las aulas de K-12, de pregrado y de divulgación científica con flotas de microscopios de fluorescencia que pueden involucrar a los estudiantes con actividades prácticas de aprendizaje.

Los avances en la tecnología de cámaras de teléfonos inteligentes y tabletas han puesto poderosas cámaras en manos de científicos, educadores y estudiantes. La resolución y sensibilidad de las cámaras modernas de teléfonos inteligentes y tabletas supera las capacidades de muchas cámaras científicas que aún se utilizan para aplicaciones de investigación. Con mejoras anuales en la sensibilidad de la cámara de los teléfonos inteligentes, la agrupación y resolución de píxeles y las capacidades de velocidad de cuadros de video, estamos entrando en una era en la que estos dispositivos pueden realizar imágenes y videos de alta calidad para la educación e investigación científica. En consecuencia, se han desarrollado productos para montar teléfonos inteligentes en oculares de microscopios para la adquisición de imágenes. Además, se han desarrollado diseños independientes de 'microscopios para teléfonos inteligentes' para su uso en entornos de educación científica K-12 y de pregrado1,2,3,4,5,6, entornos clínicos o de investigación7,8,9,10,11 y aplicaciones de geociencias12 .

La microscopía de fluorescencia produce imágenes visualmente atractivas que pueden mejorar en gran medida el contraste de las características específicas de la muestra que se está viendo. Esta modalidad de formación de imágenes microscópicas ha implicado históricamente lámparas de arco de mercurio o láseres costosos y engorrosos. Sin embargo, en los últimos años, la tecnología de diodos emisores de láser (LED) comparativamente económica y compacta está reemplazando las lámparas de arco de mercurio y los láseres en la industria de la microscopía. Las ventajas incluyen menor costo, mayor longevidad y operación libre de mantenimiento. Debido a que los LED se han diseñado para emitir luz de prácticamente cualquier longitud de onda en el espectro de luz visible y se pueden filtrar si es necesario, la comunidad de microscopía está adoptando ampliamente el uso de LED como fuente de luz de excitación para microscopía de fluorescencia.

En este estudio, nuestro objetivo fue desarrollar una configuración de imágenes de fluorescencia para teléfonos inteligentes con un precio de construcción objetivo de menos de $ 50 (dólares estadounidenses) por unidad. Demostramos la capacidad de estos dispositivos, a los que nos referimos como 'glowscopes', para detectar fluoróforos verdes y rojos y para monitorear y detectar cambios en la frecuencia cardíaca y el ritmo en embriones de pez cebra. Discutimos y demostramos oportunidades para que los educadores de pregrado y K12 usen estos recursos para cumplir con los estándares de ciencia locales y de próxima generación.

Todo el trabajo de pez cebra realizado en este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Winona. Todos los experimentos se realizaron en estricta conformidad con las pautas y regulaciones de este protocolo de cuidado y uso de animales y las pautas ARRIVE (https://arriveguidelines.org/). Ningún participante humano en el estudio de investigación estuvo involucrado. Se criaron embriones de pez cebra (Danio rerio) a 28 °C en agua de huevo (0,0623 g/L de sal marina de Coralife) y se clasificaron según las horas posteriores a la fecundación o criterios morfológicos. Las líneas transgénicas utilizadas en este estudio incluyeron Tg(olig2:DsRed)vu19, Tg(nkx2.2a:EGFP-CaaX)vu16, Tg(phox2bb:EGFP)w37, Tg(mbpa:EGFP-CaaX; myl7:mCherry) a las que se hará referencia en lo sucesivo como Tg(myl7:mCherry)13, Tg(sox10:mRFP)vu234 y Tg(UAS:EGFP-CaaX, myl7:EGFP)co18, que en lo sucesivo se denominará Tg(myl7:EGFP). Para paralizar de forma reversible los embriones y las larvas para su visualización, se añadió solución madre de metanosulfonato de tricaína (Western Chemical, Inc.) (0,116 M) directamente a la placa de Petri que contenía agua de huevo en una proporción de 0,5 a 1 ml (tricaína) por 20 ml (huevo). agua). Se usó una solución madre de astemizol (10 mM en DMSO) para tratar el pez cebra mediante la adición directa al agua de huevo para una concentración final de 10 o 30 µM (como se indica). Todos los demás animales utilizados en este estudio se recolectaron localmente antes de su uso. La visualización de insectos vivos contenidos en placas de Petri se ayudó colocando la placa sobre hielo para ralentizar el movimiento. Se utilizó un ReptiTherm UTH para aumentar la temperatura para los estudios de frecuencia cardíaca (Zoomed). La superficie de esta almohadilla térmica se midió a 35 °C en el momento del uso usando un termómetro infrarrojo. El tratamiento de embriones de pez cebra con agua ácida se realizó utilizando vinagre doméstico (10% en agua de huevo) durante 30 minutos entre la determinación de la frecuencia cardíaca antes y después del tratamiento. Para el comportamiento inducido por presas de peces, se colocó una sola larva de pez cebra (5 dpf) en una placa de Petri de 30 mm que contenía 5 ml de agua de huevo. Para observar la captura de presas de pez cebra, se mezcló previamente Paramecium bursaria (Carolina Biologicals) vivo directamente con el agua del huevo a una concentración de 30 paramecium por 1 ml, que se determinó antes de su adición mediante observación microscópica de muestras por triplicado y se diluyó para lograr esta concentración objetivo.

Una lista completa de piezas, diseño e información de ensamblaje está disponible en Métodos complementarios. Brevemente, la madera contrachapada cortada o el material compuesto se ensamblaron con una superficie de plexiglás (policarbonato o acrílico). Se perforaron agujeros en el plexiglás para proporcionar un puerto de visualización claro para la cámara del teléfono inteligente. Se cortó una pieza adicional de plexiglás para que sirviera como plataforma de escenario móvil inmovilizada por arandelas y abrazaderas. Se usó una lente macro con clip (Lieront, comprada en www.amazon.com, anunciada como macro 25X) para agregar aumento a las imágenes de los teléfonos inteligentes para la fluorescencia. Se utilizó una tabla de prueba de 1951 de la USAF (www.edmundoptics.com, catálogo n.º 3857) para determinar la resolución de imagen máxima alcanzada. Después de adquirir la imagen con el zoom digital máximo, determinamos las líneas más pequeñas que podrían separarse claramente y los lp/mm que representan (x). La resolución (en micras) se calculó como sigue: µm = 1000 / (x * 2).

Se usó un faro LED azul (Topme, comprado en www.amazon.com, anunciado como un faro de pesca) o una linterna LED multicolor (Lumenshooter, comprado en www.amazon.com, anunciado como una linterna táctica) para la iluminación GFP . Para reducir la luz parásita en las longitudes de onda verde y amarilla, se cortó una película de iluminación de gel para escenarios de teatro (Rosco #4990, CalColor Lavender) y se insertó entre el LED y la lente de enfoque del faro. Rosco #14 (paja mediana) y #312 (Canary) película de gel para iluminación de escenarios de teatro se utilizaron individualmente o en combinación como filtros de emisión. La lámpara LED se mantuvo en un ángulo de aproximadamente 45 grados por encima y dentro de 3 a 6 pulgadas de las muestras. Se colocaron filtros de emisión entre la plataforma acrílica y la lente con clip. Para obtener imágenes de proteínas fluorescentes rojas, se utilizaron Rosco #88 (verde claro) y #89 (verde musgo) para iluminación (filtros de excitación) junto con #19 (fuego) como filtro de emisión. Todos los filtros Rosco se compraron en www.stagelightingstore.com o www.bhphotovideo.com. Se utilizó un espectrómetro de emisiones Vernier (VSP-EM, www.vernier.com) para evaluar los efectos de los filtros de excitación. Se utilizó el software Vernier Spectral Analysis (versión 4.11.0–1543) para adquirir y convertir datos a formato .csv, que luego se importó a Microsoft Excel y posteriormente se usó para hacer gráficos con GraphPad Prism (versión 7.0, GraphPad). Se utilizó un Vernier LabPro acoplado a un sensor de luz (Vernier LS-BTA) para evaluar la intensidad de la luz de las linternas LED azules en combinación con el software Vernier Logger Pro 3 (versión 3.16.2). Se usó un multímetro (Amprobe 30XR-A) para medir el consumo de corriente entre la batería y el LED en el faro LED azul.

Se utilizaron dispositivos Apple y Samsung para la adquisición de imágenes. A menos que se indique lo contrario, toda la adquisición de imágenes se realizó con un iPhone XR (Apple). Para mayor comodidad, se adquirieron videos de lapso de tiempo del corazón de pez cebra embrionario utilizando la aplicación ProCam 8, que permitió bloquear la lente 1X para su uso y ampliar el zoom digital a 4.0X. Se utilizó la adquisición de video a una resolución de 1080p y 60 cuadros por segundo (fps) porque una resolución de 4 k o velocidades de cuadro más altas redujeron la sensibilidad a la fluorescencia y la relación señal:ruido. Todas las imágenes y videos se transfirieron a una computadora portátil mediante Airdrop (Apple) o un cable USB para evitar la compresión de datos de video. Los videos se importaron a Fiji14 convirtiéndolos primero en una serie de imágenes TIFF (una por cuadro) usando Adobe Photoshop. Después de abrir videos de teléfonos inteligentes en Photoshop, las imágenes se recortaron y luego se guardaron como una secuencia de imágenes usando el comando Archivo Exportar Renderizar video Secuencia de imágenes de Photoshop (formato TIFF). A continuación, la secuencia de imágenes se abrió en Fiyi mediante el comando Secuencia de imágenes de importación de archivos. Para la visualización de lapso de tiempo no fluorescente de paramecio, natación de pez cebra y respuestas de escape de renacuajos y orugas, utilizamos una resolución de 1080p con una adquisición de 120 fps.

Para los videos del corazón del pez cebra, la detección de bordes ayudó a la detección y medición de los movimientos de las cámaras del corazón en algunos videos. En estos casos, se utilizó Fiji para detectar bordes mediante el comando Procesar búsqueda de bordes. Para detectar los cambios de fluorescencia asociados con los movimientos de las aurículas y los ventrículos, se utilizó la secuencia de imágenes sin procesar o detectada en los bordes y se analizó más a fondo en Fiyi. En primer lugar, se utilizó el comando Analizar medidas del conjunto para instruir a Fiji para que midiera los valores de gris mínimos y máximos, los valores medios de gris y el límite hasta el umbral. La pila de imágenes se convirtió a escala de grises con el comando Tipo de imagen de 8 bits. En los casos en los que se produjeron desplazamientos de la imagen o movimientos no biológicos, se utilizó el comando Estabilizador de imagen de los complementos para intentar eliminar este problema. La imagen se escaneó en busca de posibles regiones de interés (ROI) donde las paredes de la cámara del corazón se movieron constantemente hacia adelante y hacia atrás a lo largo del eje x-y. Una vez que se definió un ROI, se agregó mediante la ventana del administrador de ROI de herramientas de análisis o el acceso directo "t". Simultáneamente a la identificación de una ROI, la ventana Umbral de ajuste de imagen se utilizó para establecer un umbral mediante el cual las paredes de la cámara en movimiento se movían constantemente dentro y fuera del cuadro de la ROI. Una vez que se estableció una combinación ideal de umbral de imagen y posición del cuadro de retorno de la inversión, la imagen se convirtió en datos binarios utilizando el comando Procesar binario seleccionando la configuración de fondo oscura, negra y predeterminada. Para medir la intensidad de la fluorescencia dentro del ROI a lo largo del tiempo, se utilizó la herramienta Multi Measure dentro del administrador de ROI (en la pestaña "Más") para crear un conjunto de mediciones a lo largo del tiempo. Los datos sin procesar se cortaron y pegaron directamente en una hoja de cálculo de Microsoft Excel. Dentro de la hoja de cálculo, se usaron fórmulas para identificar el inicio de cada latido del corazón usando la columna de intensidad máxima, y los gráficos se hicieron usando GraphPad Prism 7.0. El inicio de cada latido fue definido por la transición de 0 a 255.

Como un marco para soportar un teléfono inteligente o tableta para la visualización de fluorescencia, adaptamos un diseño de microscopio de bricolaje que se usa ampliamente para imágenes no fluorescentes3,4. Este marco consistía en una plataforma de plexiglás para sostener un teléfono inteligente (o tableta) encima del espécimen (Fig. 1a). Un segundo

Vista en vivo de especímenes no fluorescentes usando el marco del luminoscopio. (a) La ilustración muestra la trayectoria de la luz para la visualización con luz transmitida. Los componentes que se muestran incluyen el teléfono inteligente, la lente con clip (negra), el marco del luminoscopio (gris), el escenario y la plataforma de visualización (transparente), la placa de Petri que contiene una muestra y una lámpara de trabajo LED colocada debajo del escenario y la plataforma de visualización. (b) La vista de imagen con la cámara de un teléfono inteligente sin la lente con clip muestra embriones de pez cebra (flecha azul, 3 dpf). Se muestra un lápiz estándar (lado del borrador) como referencia de tamaño. (c) La vista de imagen con la lente con clip adicional muestra los mismos embriones de pez cebra y el mismo borrador de lápiz que se ven en el panel (b). Las imágenes que se muestran en los paneles (b–c) tienen un aumento nativo (no ampliado) como se ve en la vista en vivo, adquiridas con un Apple iPhone 12 Pro con lente 1x (ampliación media), zoom digital 6x.

La plataforma de plexiglás colocada debajo de la lente del teléfono inteligente sirvió como escenario para sostener la muestra. La altura ajustable de la platina de plexiglás aseguró la capacidad de enfocar la muestra. Tableros de madera o compuestos, tuercas, pernos y arandelas mantuvieron la plataforma y el escenario de plexiglás en su lugar. Para obtener imágenes no fluorescentes, una lámpara de trabajo LED alimentada por batería colocada debajo de la muestra proporcionaba luz adicional cuando la iluminación ambiental de la habitación era insuficiente (Fig. 1a).

Para aumentar la ampliación y la resolución más allá del teléfono inteligente o la tableta, se sujetó una lente macro 'clip-on' adicional sobre la cámara del teléfono o la tableta (Fig. 1a, c). La lente con clip adicional utilizada en este estudio proporcionó un aumento de aproximadamente cinco veces (Fig. 1b-c). Esta magnitud dependía de la distancia a la que se colocaba la muestra de la lente con clip. Al ver el pez cebra embrionario (2 a 4 días después de la fertilización), que son aproximadamente equivalentes a la longitud de un borrador de lápiz (2 a 3 mm de longitud), el aumento aumentado y la resolución de la imagen hicieron que las características del plan corporal del pez cebra se observaran fácilmente. Por ejemplo, las estructuras anatómicas que incluyen el ojo, el corazón, la yema y la cola se observaron fácilmente en la pantalla en vivo utilizando la lente con clip (Fig. 1c). Usando objetivos de prueba de la USAF, medimos una resolución de 9,8 µm usando una cámara iPhone 11 con la lente con clip adicional. Esto correspondió a mejoras significativas en la resolución de la imagen y el detalle anatómico en la vista en vivo o después de la adquisición de la imagen. Después de capturar las imágenes y estirarlas digitalmente para ampliarlas aún más en la pantalla de un teléfono inteligente o una computadora portátil, la lente con clip resolvió fácilmente las estructuras anatómicas e incluso las células pigmentarias individuales (melanocitos). En comparación, sin la lente con clip, estas mismas características eran difíciles o imposibles de ver (Fig. S1 complementaria).

Para equipar el alcance del teléfono inteligente con la capacidad de imágenes de fluorescencia, luego agregamos filtros y fuentes de luz de fluorescencia. Para ver las muestras con fluorescencia verde, apagamos la luz de trabajo LED y, en su lugar, usamos un faro o una linterna LED azul (Fig. 2a). Usamos filtros de iluminación de escenarios de teatro para bloquear la luz azul y evitar que llegue a la lente de la cámara. Para hacerlo, colocamos el filtro inmediatamente debajo de la lente con clip y el teléfono inteligente (Fig. 2a). Estos 'filtros de emisión' económicos redujeron el fondo de fluorescencia de la linterna azul mientras permitían que la fluorescencia verde de la muestra pasara a través del filtro y llegara a la cámara. Inicialmente obtuvimos un paquete de muestra de filtros de iluminación de escenarios de teatro con una amplia gama de propiedades espectrales. Después de probar numerosas opciones de color de filtro, descubrimos que la combinación de

Uso de linternas LED recreativas y filtros de iluminación de escenarios de teatro para microscopía de fluorescencia verde de teléfonos inteligentes. ( a ) Esquema de los componentes utilizados para la visualización de fluorescencia verde en el luminoscopio. ( b – d ) Imágenes de fluorescencia representativas de embriones de pez cebra transgénicos (3–4 dpf, vistas laterales) que expresan fluorescencia verde en patrones específicos de tipo celular. Las líneas de reportero vistas incluyen Tg(nkx2.2a:memGFP) (b), Tg(myl7:EGFP) (c) y Tg(phox2b:EGFP) (d). (e) La imagen muestra el luminoscopio en uso para visualización de fluorescencia verde. (f-g) Los gráficos muestran la longitud de onda de emisión de la linterna LED azul (líneas negras y azules, medidas con un espectrómetro Vernier) en comparación con el perfil de excitación de EGFP (gris, obtenido de www.fpbase.org). La región del cuadro discontinuo en el panel (f) se amplía aún más en el panel g para mostrar el efecto del filtro R4990 con mayor detalle. Las imágenes en los paneles (b–d) se adquirieron con un iPhone XR de Apple.

Los filtros de iluminación de escenarios Rosco #14 y #312 bloquearon efectivamente la luz azul mientras permitían que la señal de fluorescencia verde sólida se transmitiera a través de la cámara (Fig. 2a). Para probar la funcionalidad de esta configuración, utilizamos líneas reporteras de pez cebra transgénicas que expresaban proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) en subconjuntos de tejidos o células neurales. Por ejemplo, la configuración de fluorescencia detectó fácilmente la fluorescencia del cerebro y la médula espinal en embriones Tg(nkx2.2a:memGFP), tejido cardíaco en embriones Tg(myl7:EGFP), y tuvo la sensibilidad adecuada para detectar EGFP expresado en una subregión del cerebro posterior embrionario en embriones Tg (phox2b: EGFP) (Fig. 2b-d). Para reducir aún más la fluorescencia de fondo y mejorar la relación señal:ruido, agregamos el filtro Rosco 4990 colocado entre la linterna LED azul y la muestra (Fig. 2a). Como anécdota, este filtro de "excitación" oscureció el fondo azul verdoso con una pérdida insignificante de fluorescencia verde emitida y transmitida a la cámara del teléfono inteligente y la imagen visualizada. Usando un espectrómetro Vernier, encontramos que el filtro de excitación agregado redujo ligeramente la intensidad de la fluorescencia LED entre 460 y 500 nm (Fig. 2f-g). Esto puede explicar la fluorescencia de fondo azul reducida en las imágenes visualizadas cuando se utilizó el filtro de excitación R4990. Aunque este filtro de excitación adicional no es necesario para la visualización de fluorescencia verde, puede reducir de forma eficaz el fondo y mejorar la relación señal:ruido al visualizar muestras con fluorescencia tenue. Para evaluar más a fondo el perfil del faro LED azul, medimos el consumo de corriente a 2,5 A y la intensidad de la luz a 492 lx. Estas medidas están dentro del rango que garantiza la prevención de la exposición ocular prolongada y directa (ver 'Discusión').

También probamos LED y filtros de iluminación de escenario para ver la fluorescencia roja (Fig. 3). En lugar de una linterna azul, usamos una linterna LED verde. Como filtro de emisión colocado debajo de la lente, usamos el filtro de iluminación de escenario #19 de Rosco para bloquear la luz verde y permitir que la fluorescencia roja pase a través de la lente de la cámara (Fig. 3a). En nuestras manos, este filtro de emisión funcionó mejor cuando se duplicó y proporcionó una visualización de fluorescencia clara de las líneas transgénicas de pez cebra que expresan proteínas fluorescentes rojas. Como ejemplos, esta configuración iluminó de manera efectiva las características del cerebro y la médula espinal de los embriones Tg (olig2: DsRed), la fluorescencia del corazón en los embriones Tg (myl7: mCherry) y la fluorescencia del esqueleto de la cabeza y la mandíbula (cresta neural craneal) en Tg (sox10: mRFP) embriones (Fig. 3b-d). La linterna LED que usamos anunciaba una excitación LED de 530 nm, que entre los fluoróforos que usamos se alineaba mejor con las propiedades espectrales de DsRed. En nuestras manos, la linterna verde y los filtros de iluminación de escenario de Rosco se combinaron mejor con DsRed, pero un poco menos con las proteínas fluorescentes desplazadas hacia el rojo mRFP y mCherry (Fig. 3b-d). La fluorescencia de fondo y la relación señal:ruido mejoraron marginalmente cubriendo la linterna con filtros Rosco #88 y #89 (Fig. 3a). Este filtrado de excitación redujo la intensidad de la fluorescencia en longitudes de onda entre 540 y 580 nm (Fig. 3f-g) y puede explicar la disminución de la fluorescencia de fondo observada en las imágenes adquiridas cuando se usaron los filtros de excitación. Aunque los filtros de excitación n.° 88 y n.° 89 mejoraron la calidad de imagen y la detección de fluorescencia tenue, no fueron necesarios para obtener imágenes de fluorescencia roja en nuestras manos.

Glowscope detección de proteínas fluorescentes rojas. ( a ) Esquema de los componentes utilizados para la visualización de fluorescencia roja en el luminoscopio. En comparación con la visualización de fluorescencia verde, la linterna y los filtros se cambian, pero el resto del luminoscopio permanece sin cambios. ( b – d ) Imágenes de fluorescencia representativas de embriones de pez cebra transgénicos (3–4 dpf, vistas laterales) que expresan fluorescencia roja en patrones específicos de tipo celular. Las líneas de informes vistas incluyen Tg(olig2:DsRed) (b), Tg(myl7:mCherry) (c) y Tg(sox10:mRFP) (d). La barra de escala es de 1 mm. (e) La imagen muestra el luminoscopio en uso para visualización de fluorescencia roja. (f-g) Los gráficos muestran la longitud de onda de emisión de la linterna LED verde (líneas negras y verdes, medidas con un espectrómetro Vernier) en comparación con el perfil de excitación de DsRed (gris, obtenido de www.fpbase.org). La región del cuadro discontinuo en el panel (f) se amplía aún más en el panel (g) para mostrar el efecto de los filtros R88 + R89 con mayor detalle. Las imágenes de los paneles (b–c) se adquirieron con un iPhone XR de Apple y el panel (d) se adquirió con un iPhone 12 Pro.

Las piezas necesarias para convertir un teléfono inteligente o tableta en un microscopio de fluorescencia se resumen en la Fig. 4. En el momento de nuestras pruebas y preparación del manuscrito, las piezas necesarias se adquirieron por un total de $30-50 USD por cada luminoscopio individual (Fig. 4a ). La madera y el plexiglás fueron cortados y perforados con herramientas básicas. Los filtros de iluminación del escenario del teatro se compraron en láminas grandes y se cortaron a medida, lo que resultó en un costo de menos de $0.10 USD por unidad de filtro para esta aplicación. Las linternas LED azules y verdes estaban fácilmente disponibles en los minoristas en línea que se vendían para aplicaciones tácticas, de caza y pesca. Probamos numerosas opciones y descubrimos que las que tenían luz azul en lugar de UV funcionaban mejor para ver la proteína fluorescente verde. Nuestra fuente de luz preferida era una linterna táctica multicolor con colores azul (454 nm) y verde (530 nm), que se vendía al por menor por $ 20 USD en el momento en que se realizaron estos estudios. Al contactar a los vendedores directamente y comprar al por mayor, organizamos la compra directa a un costo mayorista (~ 50% de descuento). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre las piezas y las instrucciones de construcción en los Métodos complementarios.

Resumen de componentes de glowscope y compatibilidad con teléfonos inteligentes. (a) La tabla muestra los componentes básicos y los costos (en el momento de este estudio) en dólares estadounidenses. (b) Imágenes representativas de embriones de pez cebra Tg(phox2b:EGFP) demuestran compatibilidad con todos los dispositivos probados, pero diferencias sutiles entre varias tabletas y teléfonos inteligentes utilizados para la prueba. La barra de escala es de 1 mm.

Para evaluar la compatibilidad del glowscope con diferentes dispositivos de cámara, luego probamos las capacidades de visualización de fluorescencia utilizando varios modelos de teléfonos inteligentes y tabletas para detectar la fluorescencia verde en embriones Tg (phox2b: EGFP). De las líneas indicadoras verdes probadas inicialmente (Fig. 2b-d), Tg (phox2b: EGFP) fue la más difícil de ver porque la expresión de fluorescencia verde solo está presente en parte del cerebro posterior embrionario. Todos los dispositivos probados, incluidos los teléfonos y tabletas Samsung, Apple, Google y Motorola, detectaron la sutil fluorescencia verde en el cerebro posterior (Fig. 4b). Los dispositivos más nuevos generalmente adquirían imágenes de fluorescencia con intensidades verdes más brillantes en comparación con la fluorescencia de fondo, pero estas diferencias eran sutiles. Llegamos a la conclusión de que el uso de los modelos más nuevos de teléfonos inteligentes o tabletas no es necesario para la visualización de fluorescencia con resplandorscopio.

A continuación, probamos la capacidad del luminoscopio para detectar cambios en la frecuencia cardíaca y el ritmo utilizando imágenes de fluorescencia verde en peces cebra embrionarios. Debido a que el reportero Tg (myl7: EGFP) expresa fluorescencia verde en los cardiomiocitos, el luminoscopio y la pantalla del teléfono inteligente en vivo hicieron que los movimientos de la cámara del corazón palpitante fueran claramente observables con el tiempo (Fig. 5a). Para determinar si la configuración de imágenes era capaz de detectar cambios en la frecuencia cardíaca inducidos por fármacos, realizamos una visualización previa y posterior antes y después de 30 minutos de tratamiento con astemizol (Fig. 5b). Anteriormente conocido como Hismanal, el astemizol se usaba comúnmente como un medicamento antihistamínico para la alergia, pero se retiró del mercado en 1999 porque causaba complicaciones cardíacas raras pero fatales, como el síndrome de QT prolongado, arritmias cardíacas y taquicardia potencialmente mortal15. Estos efectos secundarios humanos fueron causados porque el astemizol bloquea los canales de K+ de tipo ERG implicados en la repolarización del potencial de acción cardíaco16 además de su modo de acción antihistamínico. Estudios previos han demostrado que el tratamiento con astemizol causa bradicardia dependiente de la dosis y el tiempo seguida de un eventual bloqueo auriculoventricular 2:1 (arritmia) y paro cardíaco en embriones de pez cebra17. Usando la visualización de fluorescencia de un teléfono inteligente de pez cebra Tg (myl7: EGFP) en tiempo real, detectamos una reducción significativa en la frecuencia cardíaca después de un tratamiento con astemizol de 30 minutos (Fig. 5b-c). Esta bradicardia inducida por el tratamiento farmacológico se observó de manera similar mientras se grababa el video (vista en vivo), al observar el video grabado en reproducción en la pantalla del teléfono inteligente o al transferir la grabación de video para verlo en la pantalla de una computadora portátil (Fig. 5d).

Glowscope detección de cambios inducidos por fármacos en la frecuencia cardíaca en embriones de pez cebra transgénico. (a) La imagen de fluorescencia izquierda muestra la expresión de GFP en el corazón de un embrión Tg(myl7:EGFP) (vista ventral). La región encuadrada se amplía aún más en la columna central, que de arriba a abajo muestra los movimientos de la cámara en un video adquirido en un teléfono inteligente iPhone 11 Pro. Para facilitar la visualización de los movimientos de la cámara, estos videos se transfirieron a una computadora portátil, se abrieron en ImageJ (software gratuito) y se procesaron mediante la detección de bordes, que delinea las paredes de las cámaras. Las flechas estáticas resaltan los movimientos de las cámaras del corazón. ( b ) Diagrama de flujo de la imagen previa y posterior de la frecuencia cardíaca del pez cebra en respuesta al tratamiento con astemizol (10 μM). (c) Los gráficos muestran la frecuencia cardíaca promedio de los embriones de pez cebra antes y después del tratamiento con astemizol. n = 10 animales medidos en un experimento independiente, P = 0,0002, prueba t pareada de dos colas. (d) Resumen de las mediciones realizadas durante la grabación del video en tiempo real (barra izquierda), vistas en el teléfono inteligente después de grabar el video (barra central) o vistas en una computadora portátil (barra derecha). N = 10 animales medidos en un experimento independiente, P = 0,942, ANOVA de una vía. Para los paneles (c–d), los puntos del diagrama de dispersión representan mediciones individuales de frecuencia (cardíaca) de pez cebra y las barras de error representan la desviación estándar.

Para probar aún más las capacidades y limitaciones de la fluorescencia de los teléfonos inteligentes, luego evaluamos la capacidad de resolver por separado las tasas de contractilidad de las cámaras de las aurículas y los ventrículos, lo que predijimos podría ser beneficioso para detectar arritmias cardíacas. En la mayoría de las grabaciones de video que capturamos, los movimientos de las cámaras individuales eran claramente visibles en algunos pero no en todos los embriones y superaban las limitaciones del luminoscopio. Para mejorar la claridad y la detección de los movimientos de la cámara, transferimos los videos del teléfono inteligente a una computadora que ejecuta el software gratuito ImageJ (también conocido como Fiji). Dentro de Fiji, el comando 'buscar bordes' proporcionó un medio simple para delinear los bordes de las cámaras del corazón y sus movimientos a lo largo del tiempo (Fig. 6a–c). Al monitorear los cambios de intensidad de fluorescencia específicamente dentro de un cuadro de pequeña región de interés (ROI), detectamos movimientos oscilantes de la pared de la cámara del corazón dentro y fuera del ROI con el tiempo (Fig. 6c-d). Este método proporcionó una separación clara de las tasas de contractilidad auricular y ventricular utilizando el dispositivo de teléfono inteligente (Fig. 6c-d). Los gráficos generados a partir de videos grabados antes y después del tratamiento con astemizol mostraron diferencias notables. Antes del tratamiento, ambas cámaras latían rápidamente y en un patrón alterno. En comparación, el tratamiento de 30 minutos con una dosis alta de astemizol (30 µM) provocó bradicardia y arritmia graves, como lo demuestra el estancamiento del ventrículo durante cada latido de la aurícula (Fig. 6d).

Glowscope detección de arritmia cardíaca inducida por fármacos. (a–b) Las imágenes fijas de un video de glowscope (adquirido en un iPhone 11 Pro) muestran las cámaras de la aurícula y el ventrículo en un embrión de pez cebra Tg(myl7:EGFP) de 3 dpf. Las imágenes muestran la vista sin editar (sin editar) de la fluorescencia del corazón directamente desde la grabación de video del teléfono inteligente (a) o una vista procesada del mismo corazón después de realizar la detección de bordes en una computadora usando Fiji (b). Los rectángulos azul y magenta muestran las regiones de las cámaras del ventrículo y la aurícula utilizadas para la visualización y el análisis de gran aumento en (c–d). (c) Las imágenes muestran un curso temporal (de arriba a abajo) de los movimientos de la cámara del ventrículo (izquierda) o la aurícula (derecha) detectados por el luminoscopio (correspondiente a las regiones encuadradas en el panel b). Las pequeñas regiones de interés encuadradas con guiones se usaron para controlar los cambios de intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo. Los asteriscos resaltan los cuadros en los que la pared de la cámara del corazón se ha movido a la región de interés con respecto al cuadro anterior. ( d ) Los gráficos de intensidad de fluorescencia frente al tiempo trazados para la cámara de la aurícula y el ventrículo revelan movimientos de cámara oscilantes. Las mediciones dentro del mismo embrión (N = 1) se adquirieron y analizaron por separado antes (superior) y después del tratamiento con astemizol (inferior). La intensidad de fluorescencia máxima (en unidades arbitrarias) dentro de la región de interés encuadrada en el cuadro de guiones que se muestra en el panel (c) se obtuvo y trazó para cada marco de tiempo de la grabación de video, lo que resultó en un pico de fluorescencia cada vez que la cámara de fluorescencia entró y ocupó el región de interés encuadrada. Tenga en cuenta las diferencias en la frecuencia cardíaca entre el control y los corazones tratados con astemizol, así como el patrón de latido auricular: ventricular arrítmico 2:1 inducido por el tratamiento con astemizol (gráfico inferior, 30 μM). Las flechas azules en el panel (d) muestran latidos ventriculares perdidos. Videos disponibles en el video complementario S1.

Además de su uso para la microscopía de fluorescencia, el marco del luminoscopio y la lente con clip también pueden ser útiles para ver muestras no fluorescentes y se han utilizado ampliamente en algunos entornos de divulgación científica3,4. En nuestras manos, una lámpara de trabajo LED colocada debajo del espécimen funcionó bien para especímenes transparentes como embriones y larvas de pez cebra (Figs. 1, 2, Fig. S2 complementaria). Reconociendo que la luz transmitida puede ser ineficaz para ver especímenes no transparentes, a continuación comparamos opciones de iluminación alternativas para especímenes transparentes y no transparentes. Al ver especímenes como renacuajos o insectos, descubrimos que era ventajoso colocar la luz al lado o encima (epi-iluminación) del espécimen (Fig. S2 complementaria). Cualquiera de las opciones se puede lograr sosteniendo la lámpara de trabajo LED en la posición deseada con la mano. Como una opción más conveniente para la epi-iluminación, reutilizamos las tiras de luces LED COB alimentadas por USB (consulte Métodos complementarios). Estas luces económicas normalmente se venden para la iluminación de gabinetes y armarios domésticos y tienen un respaldo adhesivo (cinta), lo que nos permitió unirlas debajo del plexiglás inmediatamente encima de la muestra (Fig. S2 complementaria). Estas opciones de iluminación alternativas pueden ser útiles cuando se desea la versatilidad del tipo de espécimen, pero no fueron necesarias para nuestra observación de embriones y larvas de pez cebra.

Glowscopes puede ser adecuado para algunas aplicaciones de investigación, pero nuestro principal motivador para su desarrollo fue satisfacer las necesidades de los educadores de ciencias y los programas de divulgación. En los Estados Unidos, las recomendaciones para la educación en ciencias de la vida en los niveles K-12 y de pregrado implican aumentar el aprendizaje activo y práctico18. Estas recomendaciones restan énfasis a la transferencia de información basada en conferencias como un único medio para el aprendizaje de los estudiantes y, en cambio, sugieren que los estudiantes aprendan ciencias realizando ellos mismos el método científico de manera iterativa. Un desafío inherente a esta transformación pedagógica es la mayor presión sobre los docentes para que desarrollen nuevas actividades prácticas de aprendizaje que sean atractivas y respalden los objetivos de aprendizaje basados en disciplinas. El glowscope puede ser una de las muchas herramientas que es económica, interesa y emociona a los estudiantes, y puede apoyar el aprendizaje práctico en las aulas. Para ayudar a su opción, los videos que documentan su uso y las instrucciones de ensamblaje están disponibles en un canal de glowscopes alojado en YouTube en https://www.youtube.com/channel/UCoRglCdvrtqwkBcvP10ibDg.

Para evaluar las oportunidades potenciales para su uso, primero examinamos los Estándares de Ciencias de la Próxima Generación (NGSS, por sus siglas en inglés) K-12. Identificamos las ideas centrales disciplinarias del NGSS compatibles con el uso del luminoscopio en los niveles de grado 1, 3, MS (escuela intermedia, grados 6 a 8) y HS (escuela secundaria, grados 9 a 12), y desarrollamos una tabla de actividades de aprendizaje estudiantil propuestas en cada uno de estos niveles (Tablas complementarias S1–S3). Dentro de estas tablas, las actividades de aprendizaje de los estudiantes propuestas se basan en los luminoscopios de diferentes maneras. Por ejemplo, algunas actividades usan fluorescencia mientras que otras usan visualización no fluorescente. El uso inicial de luminoscopios sin fluorescencia puede preparar mejor a los usuarios para el uso posterior de la fluorescencia, que es técnicamente más desafiante. Muchas actividades proponen el uso de embriones de pez cebra, pero se pueden usar otros organismos, ya sea recolectados localmente o comprados a proveedores biológicos. Si se desea utilizar embriones de pez cebra, los educadores deben conocer www.zfin.org como un medio para buscar laboratorios de investigación cercanos que ya utilicen peces cebra en su área, lo que puede brindar una oportunidad de acceso local para obtener embriones o albergar adultos.

A continuación, realizamos una serie de experimentos piloto para proporcionar ejemplos representativos de actividades de aprendizaje de estudiantes compatibles con NGSS para la educación o divulgación de STEM. En el grado 1, NGSS recomienda que los educadores involucren a los estudiantes en la realización de observaciones, así como en la competencia apropiada para el grado en el análisis e interpretación de datos. Primero nos enfocamos en las ideas centrales específicas que abordan cómo los descendientes de los mismos padres pueden variar en apariencia y los tipos de comportamientos que ayudan a los descendientes a sobrevivir (Figura complementaria S3). En estos ejemplos, los estudiantes usan luminoscopios no fluorescentes para ver animales en una pantalla de teléfono inteligente o tableta y desarrollan tablas para registrar sus observaciones. Para abordar cómo los comportamientos de las crías les ayudan a sobrevivir, usamos un lápiz para tocar suavemente los embriones, observar su respuesta y construir tablas para las observaciones y las partes del cuerpo involucradas en estas respuestas observadas. Aunque se muestra para renacuajos y orugas de monarca (Fig. S3 complementaria), esta actividad sería compatible con el pez cebra o muchos insectos o gusanos recolectados localmente. Los maestros deben usar discreción en cuanto a si la destreza manual está lo suficientemente desarrollada como para que los estudiantes puedan evitar causar daños innecesarios a los especímenes.

Una pregunta adicional abordada en las ideas centrales de Grado 1 es cómo los animales capturan la información necesaria para crecer y responder de una manera que les ayude a sobrevivir (Fig. 7a). El pez cebra primero obtiene la capacidad de observar visualmente los alimentos, rastrear y atacar los alimentos en movimiento (presas) y usar su mandíbula para comer alimentos durante su primera semana de vida19,20. Los paramecios son una fuente de alimento de uso común para los peces cebra jóvenes. Estos organismos unicelulares "nadan" en el agua utilizando cilios para impulsar sus movimientos. Los individuos pueden tener hasta 0,5 mm de longitud y son difíciles de ver a simple vista, pero sus movimientos en placas de Petri que contenían larvas de pez cebra se observaron fácilmente usando un teléfono inteligente con lentes con clip (Fig. 7b). La adición de paramecio a la placa de Petri que contenía pez cebra aumentó la frecuencia de los eventos de nado (Fig. 7c-e). Proponemos que los estudiantes comparen las placas de Petri sin alimentación con las alimentadas (que contienen paramecio) y observen los tipos de comportamientos y las partes del cuerpo utilizadas para responder a la presencia de paramecio (Fig. 7f). Estas respuestas son esenciales para el crecimiento y la supervivencia e involucran múltiples sistemas orgánicos.

Actividad de aprendizaje para estudiantes de primer grado que aborda las ideas centrales de NGSS sobre las partes del cuerpo animal necesarias para sobrevivir. (a) Descripción del estándar NGSS y actividad estudiantil propuesta. (b) El transcurso del tiempo (izquierda, serie de imágenes grises) muestra dos paramecios móviles (flechas azul y negra) en el mismo campo de visión que una larva de pez cebra paralizada (que se muestra para comparar la escala). La imagen en color de la derecha es una proyección de tiempo de máxima intensidad, que traza el píxel más brillante de cada cuadro en un video de lapso de tiempo y, por lo tanto, marca la trayectoria de cada paramecio (verde). Se agregó color a esta imagen usando la función de texturizador en PowerPoint. (c) Esquema de la actividad de aprendizaje de los estudiantes que compara el comportamiento de natación y seguimiento de presas entre un plato que contiene larvas de pez cebra sin comida (paramecio) versus hermanos en presencia de paramecio. ( d ) La serie de imágenes Timecourse muestra la larva del pez cebra en ausencia o presencia de paramecio en la placa de Petri. Tenga en cuenta la relativa falta de movimiento en los controles (superior, plato 1) en comparación con el plato tratado con paramecio (inferior, plato 2). El curso de tiempo que se muestra en (d) representa 33 ms. (e) El gráfico muestra la diferencia en la frecuencia del comportamiento de nado de larvas de peces (5 dpf) entre los grupos propuestos en (d). N = 4 larvas por condición obtenida en un experimento independiente; las barras muestran la media ± error estándar; P = 0,0911, prueba t pareada de dos colas. (f) Ejemplo de observaciones de estudiantes que comparan grupos del panel (d) y proponen las partes del cuerpo involucradas en los comportamientos de seguimiento de presas. Las imágenes se adquirieron utilizando un Apple iPhone 12 Pro con (b) y sin (d) la lente macro con clip.

En las ciencias de la vida de la escuela secundaria (grados 9 a 12), las ideas centrales de NGSS se centran en los genes, los mecanismos de herencia y el efecto de los genes y el medio ambiente en la visualización de rasgos. Para abordar la influencia del medio ambiente en la visualización de rasgos, desarrollamos una forma de usar luminoscopios para monitorear los cambios inducidos por la temperatura y la acidez del agua. En estas actividades de aprendizaje, los estudiantes pueden investigar cómo el pez cebra individual muestra cambios en la frecuencia cardíaca embrionaria en respuesta a estos estímulos ambientales (Figura complementaria S4). Demostramos actividades simples que comparan la frecuencia cardíaca antes y después de colocarlas en una almohadilla para reptiles a 35 ° C durante 10 minutos (Fig. S4 complementaria). Los peces también pueden experimentar cambios en su entorno en forma de acidez del agua. Para modelar esto, agregamos vinagre doméstico al agua y observamos una disminución de la frecuencia cardíaca después de 25 minutos de inmersión en agua ácida (Figura complementaria S4).

Además de observar los rasgos y su dependencia de la genética y el medio ambiente, las ideas centrales del NGSS también enfatizan los mecanismos de la herencia genética en el nivel secundario (Fig. 8a). Debido a que los transgenes son rasgos dominantes y se heredan en patrones mendelianos, el uso de "rasgos luminosos" de pez cebra puede ser una forma divertida y útil para que los estudiantes aprendan los cuadros de Punnett. En esta actividad de aprendizaje, a los estudiantes se les proporcionan varias placas de Petri, cada una de las cuales contiene embriones de diferentes cruces parentales (Fig. 8b). Primero, los estudiantes observan cada plato y la proporción de descendientes que muestran el 'rasgo de brillo'. Luego, los estudiantes desarrollan cuadros de Punnett para todos los genotipos parentales posibles, resaltan qué genotipos descendientes mostrarán fenotipos dominantes y luego comparan sus datos observados con uno o más cuadros de Punnett. Luego, los estudiantes pueden usar sus modelos para evaluar y discutir los posibles genotipos parentales para cada plato de descendencia.

Actividad de aprendizaje para estudiantes de NGSS de los grados 9 a 12 centrada en la genética y la herencia. (a) Descripción del estándar NGSS y actividad estudiantil propuesta. ( b ) Imágenes representativas de fluorescencia de glowscope de 4 dpf Tg (myl7: EGFP) larvas de pez cebra utilizadas para determinar la proporción que hereda el rasgo de corazón verde (indicado por flechas blancas). Los datos tabulados, cada conjunto obtenido de un solo embrague de embriones de pez cebra, se comparan con los cuadrados de Punnett que son consistentes con las proporciones fenotípicas de descendencia observadas. Las imágenes se adquirieron con un Apple iPhone 12 Pro.

En este estudio, desarrollamos y caracterizamos componentes para convertir un teléfono inteligente o una tableta en un microscopio de fluorescencia de baja calidad por un costo de $50 (dólares estadounidenses) o menos por unidad. Estos dispositivos de construcción propia, a los que nos referimos como luminoscopios, son capaces de generar imágenes de fluoróforos verdes y rojos con una resolución de hasta 10 µm y aprovechan las capacidades de alta velocidad de fotogramas de las cámaras de los teléfonos inteligentes para grabaciones de video. El principal avance de este estudio es el desarrollo de la visualización de fluorescencia verde y roja utilizando linternas LED recreativas de bajo costo y filtros de iluminación de escenarios de teatro, que deberían ser compatibles con diseños de microscopios distintos del teléfono inteligente y la lente con clip que usamos en nuestro estudio. Debido al bajo costo, el diseño específico que caracterizamos e informamos en este estudio debería hacer posible equipar aulas enteras con múltiples luminoscopios, aumentando así la cantidad de tiempo que los estudiantes pueden trabajar con experimentos. Además, imaginamos que los luminoscopios podrían ser útiles para algunas aplicaciones de investigación que no requieren gran aumento y tienen especímenes fluorescentes brillantes. Por ejemplo, esto puede permitir que los laboratorios adquieran simultáneamente datos de video de muchos luminoscopios al mismo tiempo, lo que puede no ser posible para los laboratorios que no tienen acceso a varios microscopios de fluorescencia.

Si se usa en combinación con otros microscopios para teléfonos inteligentes de bajo costo o de bricolaje, como Foldscopes, los laboratorios o los estudiantes en las aulas pueden realizar una variedad de imágenes microscópicas con tabletas y teléfonos inteligentes. Específicamente, los Foldscopes pueden lograr una magnificación al menos cinco veces mayor (superando la resolución de 2 µm) que la configuración de los luminoscopios que probamos, lo que convierte a los Foldscopes en dispositivos potentes para imágenes de teléfonos inteligentes no fluorescentes2. Esta resolución añadida viene con compensaciones que pueden complementarse con luminoscopios. Además de las diferencias en la capacidad de fluorescencia, la ampliación añadida del Foldscope tiene la desventaja de reducir las distancias de trabajo, lo que puede dificultar o imposibilitar el trabajo con organismos acuáticos o muestras en placas de Petri. En comparación, la lente con clip del luminoscopio que usamos en este estudio tiene distancias focales más largas y flexibles que la hacen compatible con especímenes grandes y el uso de placas de Petri, y se puede usar para visualización no fluorescente con o sin la lente con clip. lente macro. Si se usa sin la lente con clip, la distancia focal entre el teléfono inteligente y la muestra es del orden de 5 a 10 cm. De esta forma, el marco del luminoscopio, con la cámara del teléfono inteligente, puede servir como un microscopio de disección básico.

El glowscope es ahora una de varias formas de realizar microscopía de fluorescencia utilizando un microscopio de teléfono inteligente. Cada uno de los diferentes métodos y accesorios para lograr la visualización de fluorescencia con un teléfono inteligente tiene sus propias ventajas y desventajas según la aplicación deseada por el usuario. Por ejemplo, existen opciones si la muestra es compatible con un portaobjetos, que se puede insertar en un aparato impreso en 3D que se conecta al teléfono inteligente21,22,23. Estos enfoques pueden ofrecer una mayor ampliación y resolución que la lente macro con clip utilizada por los luminoscopios. Un inconveniente es que los archivos adjuntos impresos en 3D solo pueden funcionar con ciertos modelos de teléfonos inteligentes. La restricción de insertar portaobjetos también limita la distancia de trabajo, la capacidad de disección y la compatibilidad con especímenes como renacuajos vivos o embriones de pez cebra que deben sumergirse en agua. Otro método más consiste en cambiar permanentemente la lente del teléfono conectando los filtros directamente a la lente24. Este enfoque puede funcionar en un entorno de investigación en el que se puede dedicar un dispositivo de teléfono inteligente para este propósito, pero no es una buena opción si los dispositivos propiedad de la escuela o del estudiante se usan para otros fines y no se pueden modificar de forma permanente.

Nuestras pruebas en este estudio se realizaron con embriones y larvas de pez cebra, pero el microscopio del teléfono inteligente no solo es compatible con el pez cebra. Sin embargo, si se desea usar el luminoscopio en entornos de educación K-12 o de pregrado, los acuarios de pez cebra y los grupos de investigación se han vuelto comunes en la mayoría de los colegios y universidades y se pueden ubicar utilizando el sitio web de ZFIN para buscar miembros de la comunidad (personas) por ubicación (dirección; Nombre de la ciudad). Esto hace posible la adquisición de embriones de pez cebra en la mayoría de las ciudades importantes. Ya existen muchos programas de divulgación de STEM que brindan pez cebra a los educadores locales y, en algunos casos, capacitan a los educadores25,26,27. Además, con una instrucción y un equipo mínimos, los educadores podrían comprar GloFish adultos en tiendas minoristas locales o en línea, criar peces en tanques pequeños y adquirir sus propios embriones con la frecuencia deseada. Existen muchas líneas indicadoras transgénicas que expresan fluoróforos rojos y verdes en diversos tipos de células y tejidos y se pueden obtener a través de centros de recursos o comunicándose directamente con los laboratorios. Según nuestras observaciones, cualquier línea transgénica que exprese EGFP o fluoróforos rojos sería compatible con los luminoscopios. Sería ventajoso seleccionar aquellos con una expresión de reportero fluorescente más brillante, una expresión más extendida (más células y tejidos) y con proteínas fluorescentes que coincidan más estrechamente con la longitud de onda del LED de la linterna. Por ejemplo, las linternas LED recreativas de ~450 nm y 530 nm que probamos funcionaron mejor con EGFP y DsRed, respectivamente.

Las recomendaciones de educación científica y la pedagogía basada en la evidencia se han alejado del método de lectura tradicional y la memorización de información por parte del alumno. En cambio, los estudios de enseñanza y aprendizaje indican que un aprendizaje más activo y basado en la investigación involucra a los estudiantes y respalda mejores resultados de aprendizaje28. Proporcionar a los estudiantes la oportunidad de hacer sus propias observaciones, formar modelos y predicciones, adquirir e interpretar datos y utilizarlos para revisar sus modelos y su comprensión son conclusiones comunes de los estudios de educación en ciencias de la vida, así como de las recomendaciones de NGSS y Vision and Change in Undergraduate Biology Education.15 ,29. El uso de dispositivos como los luminoscopios y los pliegues puede apoyar estos objetivos de permitir que los estudiantes aprendan sobre ciencia haciendo ciencia. De esta manera, los estudiantes desarrollarán su propia comprensión de los conceptos en lugar de tratar de absorber la información entregada en formato de conferencia.

Nuestro estudio se basó principalmente en el pez cebra para actividades de aprendizaje de educación científica. Los embriones o larvas de pez cebra transgénicos que brillan intensamente ofrecen a los estudiantes la oportunidad de explorar principios fundamentales como genes y proteínas, herencia, fisiología, comportamiento animal, ciclos de vida y desarrollo de organismos. Además, el pez cebra también puede ser una herramienta útil para abordar las interacciones entre los organismos y el medio ambiente debido a la facilidad de agregar factores al agua del embrión en la placa de Petri. Por ejemplo, la estructura y función del corazón del pez cebra, que se puede ver fácilmente en el luminoscopio, está influenciada por herbicidas, pesticidas, fungicidas, alcohol y tabaco30,31,32,33,34. Estas y otras recomendaciones enumeradas en las Tablas complementarias S1–S3 pueden proporcionar una línea de base sobre cómo los educadores pueden usar los luminoscopios para entusiasmar a los estudiantes de todas las edades, para hacer coincidir las actividades de aprendizaje con las ideas centrales disciplinarias de NGSS y para abordar las prácticas de ciencia e ingeniería de NGSS. Vale la pena señalar que los luminoscopios o dispositivos similares podrían ser útiles para actividades no biológicas como las geociencias, el arte, la óptica, la electrónica o la informática. Por ejemplo, un software como ij.imjoy.io se puede usar en teléfonos celulares para controlar directamente la cámara, lo que agregaría una funcionalidad más avanzada y podría servir para enseñar a los estudiantes cómo trabajar con codificación básica y macros35.

Una posible limitación de incorporar luminoscopios en las aulas K-12 es la accesibilidad de los dispositivos. Nuestras pruebas muestran que los luminoscopios son compatibles con dispositivos Apple, Samsung, Google y Motorola. En promedio, estos dispositivos representan aproximadamente el 95% de los utilizados en el mercado de los Estados Unidos36,37,38. Aunque todavía no hemos probado con otros dispositivos como LG o Huawei, según la compatibilidad universal con los dispositivos que hemos probado, esperamos que estos funcionen de manera similar. Es posible que a los estudiantes en algunas aulas K-12 no se les permita usar dispositivos personales. Sin embargo, todos los distritos escolares con los que nos comunicamos (N = 4) entregan iPads de Apple a los estudiantes o tienen flotas de dispositivos que se pueden llevar a las aulas para usar cuando sea necesario. Una segunda limitación o desafío asociado con los luminoscopios es el suministro constante de lentes y linternas LED azules. Los minoristas de ladrillo y mortero normalmente no llevan LED azules o adaptadores de lentes de teléfonos inteligentes adecuados para esta aplicación, o solo lo hacen de manera intermitente. Por lo tanto, compramos piezas de minoristas en línea, pero descubrimos que a menudo no se proporcionan números de pieza específicos y que la disponibilidad del producto puede cambiar con frecuencia. La información detallada de las piezas en los Métodos complementarios se puede utilizar para superar posibles problemas con el suministro de LED y lentes con clip. Una solución simple para esto podría ser la linterna LED multicolor (Lumenshooter) que usamos para la visualización de fluorescencia roja, que también funcionó bien para la visualización de fluorescencia verde cuando se usaba su configuración de luz azul. Amazon ha continuado almacenando este producto durante todas nuestras fases de investigación y preparación de manuscritos. Es probable que una amplia gama de productos distintos de los que enumeramos en este estudio funcionen para esta aplicación, pero es posible que se necesiten algunas pruebas iniciales antes de ampliar. Los LED azules o azul real (~ 450 nm) funcionan de manera más óptima para excitar los fluoróforos verdes que las luces azul-púrpura con cambio de UV (por ejemplo, 405 nm), que se venden más comúnmente en los minoristas tradicionales. Si un usuario experimenta dificultades para determinar qué fuentes de luz son las más adecuadas y no es posible realizar pruebas prácticas con la muestra deseada, ponerse en contacto con el departamento de física de una universidad local debería ofrecerle un fácil acceso a un espectrómetro que pueda probar longitudes de onda con un tiempo y esfuerzo mínimos.

Una limitación o inconveniente adicional implica el uso de LED azules, que podrían ser potencialmente peligrosos si los estudiantes dirigieran la luz hacia sus ojos de forma no intencionada39. El faro LED azul utilizado en nuestros estudios mostró un consumo de corriente e intensidades de luz en el rango identificado como "no representa un peligro debido a la respuesta de aversión a la luz brillante o al malestar térmico" (RG-2), como se define en las pautas IEC 62471 sobre seguridad fotobiológica de lámparas y sistemas de lámparas40. Este LED azul fue suficiente pero no superado para detectar fluorescencia verde en embriones. Por lo tanto, es probable que cualquier luz LED azul utilizada para la visualización de fluorescencia de un teléfono inteligente deba usarse con cierta precaución. Una solución sería montar la luz LED en un soporte, lo que reduciría la exposición ocular accidental y no accidental y también estabilizaría la luz para una mejor recopilación de datos. Según nuestras conversaciones con varios maestros, administradores y especialistas en educación científica, las luces LED ya son comunes en las aulas de ciencias de primaria, incluidos los grados 3 y superiores. Los educadores deben ser conscientes de que las longitudes de onda azules pueden ser más dañinas que las linternas blancas o de otros colores, y que los punteros láser pueden representar un riesgo de seguridad aún mayor que las linternas. Instamos a la precaución y la discreción de los maestros al usar luces fluorescentes azules en las aulas de los primeros años de la primaria. El uso de luminoscopios no fluorescentes por parte de los estudiantes en las primeras aulas de primaria puede familiarizarlos con la microscopía de teléfonos inteligentes y prepararlos para un uso de fluorescencia más avanzado con los mismos dispositivos en grados posteriores. Esto coincidiría con una edad apropiada en la que los estudiantes son capaces desde el punto de vista conductual de seguir las pautas de seguridad.

Todos los conjuntos de datos están disponibles previa solicitud al autor correspondiente.

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Descargar referencias

Agradecemos a Erika Vail (Universidad Estatal de Winona) por su asistencia técnica, Carl Ferkinhoff (Universidad Estatal de Winona), Andrew Ferstl (Universidad Estatal de Winona) por sus consejos y el intercambio de instrumentos, y Amblynn Reisetter (Escuelas Públicas de Winona) por sus útiles comentarios. Este trabajo fue apoyado por el premio NSF CAREER IOS-1845603 (JHH) y el premio de Proyectos Especiales de la Fundación de la Universidad Estatal de Winona 251.0342 a Heather Nelson.

Departamento de Biología, Universidad Estatal de Winona, Winona, MN, EE. UU.

Madison A. Schaefer, Heather N. Nelson, John L. Butrum, James R. Gronseth y Jacob H. Hines

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JHH y HNN concibieron el proyecto. MAS, JHH, JLB y JRG realizaron experimentos. JHH y MAS escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Jacob H. Hines.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Schaefer, MA, Nelson, HN, Butrum, JL et al. Un microscopio de fluorescencia para teléfonos inteligentes de bajo costo para investigación, educación en ciencias de la vida y divulgación STEM. Informe científico 13, 2722 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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Recibido: 26 Agosto 2022

Aceptado: 31 de enero de 2023

Publicado: 09 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29182-y

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